T세포 배양 성장 모니터링을 위한 백색광 분광법

소개

고급 치료 의약품(ATMP)은 치료 옵션이 제한적인 환자에게 혁신적인 치료법을 제공하는 새로운 종류의 의약품입니다. 이러한 치료법은 종종 유전자 변형 및 조직 공학과 같은 복잡한 공정을 관련하여 생산 비용이 많이 들고 소수의 환자에게만 국한됩니다. 비용을 절감하고 접근성을 높이는 잠재적인 해결책은 생산 공정, 특히 확장 단계에서 T세포 성장 모니터링을 자동화하는 것입니다. 전통적인 세포 계수 방법은 효과적이지만 일반적으로 샘플링과 관련이 있어 오염을 유발하고 생산 시간을 늘릴 수 있습니다. 이 응용 노트에서는 백색광 분광법을 사용하여 T세포 배양 성장을 모니터링하는 실시간 비침습적 방법으로 ATMP 생산을 위한 보다 효율적인 대안을  제공합니다.

행동 양식

이 응용 프로그램에서는 흡수 시스템이 사용됩니다. 전통적으로 세포 배양에서 세포 농도 추정은 세포 수를 직접 측정하는 데 의존합니다. 세포 크기 덕분에 일반적인 현미경으로 직접 관찰할 수 있기 때문입니다. 반대로 탁도계나 Beer-Lambert 법칙에서 파생된 기술(예: 광학 밀도 측정)과 같은 흡광 기반 방법은 박테리아와 같은 더 작은 생물학적 개체를 고려할 때 일반적으로 선호됩니다.

목적은 다양한 농도에서 세포 용액의 흡수 스펙트럼을 측정하고 세포 농도를 스펙트럼 거동의 함수로 플로팅하는 것입니다. 이를 "광학 농도 모델링(OCM)"이라고 합니다.

그림 1a는 분광 측정의 재현성과 정확성이 매우 우수함을 보여줍니다. 이는 OCM을 사용하여 플라스크에 있는 세포 수를 계산할 때 확인됩니다. 결과는 그림 1b에 나와 있으며, 분광 측정은 빨간색 별로 표시되어 있으며, 앞서 제시한 자동 세포 계수기로 얻은 결과와 함께 표시되어 있습니다. OCM으로 15주차에 측정한 SD는 중간값이 2% 미만이고 극단값은 0.4%와 3%입니다. 그림 1(b)에서 강조된 것처럼 플라스크에 있는 세포 수는 예상대로 시간이 지남에 따라 기하급수적으로 증가합니다.

Figure 1: 백색광 흡수 분광법을 사용하여 세포 수를 모니터링합니다. (a) 15주차에 기록된 원시 스펙트럼입니다. 색상은 날짜를 나타내며 같은 날 기록된 스펙트럼은 같은 색상으로 그려집니다. (b) OCM(빨간색 별)을 사용하여 계산한 총 세포 수를 자동 카운터가 있는 플라스크와 큐벳에서 얻은 수와 비교합니다.

모든 실험에 해당하는 SD는 그림 2에 보고되어 있습니다. 각 상자에서 이상치는 빨간색 십자가를 사용하여 개별적으로 표시됩니다. 분광 측정은 가장 낮은 평균값(2%)으로 이어지고 자동 카운터로 얻은 평균값은 훨씬 더 큽니다(플라스크의 경우 8.5%, 큐벳의 경우 10%). 또한, 플라스크에서 직접 용액을 샘플링하는 것보다 큐벳에서 용액을 샘플링할 때 데이터 분산이 더 큰 것으로 보입니다.

Figure 2: 8개 모니터링 실험 동안 측정된 SD를 나타내는 상자와 수염 그림(%). 이상치는 빨간색 십자가를 사용하여 개별적으로 표시됩니다.

그림 3은 15주차에 얻은 데이터를 플라스크, 큐벳 및 분광기에서 각각 측정한 세포 수에 시간을 적용하여 지수적으로 맞춘 것을 보여줍니다. 이 예에서 피팅의 R2는 플라스크, 큐벳 및 분광기에 대해 각각 0.97, 0.92 및 0.99였습니다. 보고된 초기 세포 수는 플라스크, 큐벳 및 분광기에 대한 조정된 데이터의 결과입니다. 플라스크는 처음에 5×105 CEM.mL-1의 CEM 농도로 접종되었습니다. 초기 배양 부피는 15mL이므로 이론적 초기 세포 수는 7.5×106 세포와 같습니다. 계산 방법이 무엇이든 관찰된 초기 세포 수가 이론적 세포 수보다 높다는 점에 유의할 수 있습니다.

Figure 3: 15주차에 얻은 실험 데이터를 지수 함수에 적용합니다.

분열 시간은 분광 데이터의 피팅을 통해 결정되었습니다. 범위는 30~50시간입니다. 마지막으로, 분열 시간과 초기 세포 수 사이에도 약한 상관 관계가 발견되었으며(그림 4), 상관 계수 R2=0.87입니다. 그림 4에서 데이터는 설명을 위해 지수 함수로 피팅되었습니다. R2의 낮은 값으로 인해 진화가 실제로 지수 함수라는 결론을 내릴 수 없습니다.

Figure 4: 초기 세포 수에 따른 분열 시간의 진화.

그림 4는 분열 시간이 초기 세포 수에 따라 증가함을 보여줍니다. 즉, 세포 수가 많아질수록 세포가 더 느리게 성장한다는 것을 의미합니다. 이는 다양한 단계를 나타내는 세포 성장 동력학과 일치합니다. 그중에서도 영양소 고갈 및 노폐 대사산물 증가와 같은 환경 변화가 정상 단계로 이어질 때까지 계속되는 지수 단계가 있습니다. 그림 4에서 관찰되는 진화는 더 많은 세포 수가 배양을 정지 단계 조건에 더 가깝게 만들기 때문에 논리적입니다.

빌드

INTINS는 이 애플리케이션을 위한 완벽한 시스템을 제공할 수 있습니다. Ocean SR4 UV-VIS 분광기는 다양한 애플리케이션을 위한 고속 스펙트럼 수집 및 뛰어난 신호 대 잡음비 성능을 갖춘 고성능 분광기입니다. 이 소형 장치는 190-1100 nm 범위의 UV-VIS 데이터를 제공하며5µm에서 200µm 폭의 진입 슬릿 옵션을 제공합니다. SR4 분광기는 소형이고 다재다능하며 Ocean Insight 광원 및 액세서리와 호환됩니다.

DH-2000 시리즈는 세계 유일의 균형 잡힌 중수소 할로겐 소스입니다. 혁신적인 필터링 기술을 사용하여 전체 범위에 걸쳐 매끄러운 스펙트럼을 생성하고 215~2500nm에서 균형 잡힌 출력을 제공하며 포화와 관련된 문제를 제거합니다. 이 동일한 기술은 가시광선 영역에서 알파-중수소 선을 제거합니다. 중수소와 할로겐 램프를 조합하여 사용하는 DH-2000은 유연하고 다양한 스펙트럼 영역에서 여러 가지 특징이 있는 샘플을 측정하거나 다양한 샘플을 분석하는 데 이상적입니다.

1cm 경로 길이의 큐벳용 큐벳 홀더는 SMA 종단 광섬유를 통해 분광기와 광원에 연결되어 흡수 및 형광 실험을 위한 소형 스펙트럼 시스템을 만듭니다. 큐벳 홀더는 주변광을 제거하기 위한 완전 통합 뚜껑이 있으며, 큐벳 홀더에 들어오는 조명광 및/또는 큐벳 홀더에서 나가는 감지된 빛을 필터링할 수 있는 2개의 필터 슬롯이 있습니다. 이 장치는 사용자 조정 없이 1cm 정사각형 큐벳을 단단히 고정하도록 설계되어 높은 데이터 반복성을 제공합니다.

결론

백색광 분광법은 T세포 배양 성장을 실시간으로 모니터링하는 강력하고 비침습적인 방법을 제공하여 기존 세포 계수 방법보다 더 높은 정확도와 재현성을 제공합니다. 이 접근 방식은 오염 위험을 줄일 뿐만 아니라 ATMP 생산 공정의 효율성을 향상시킵니다. 향후 개발은 이 분광 모니터링 시스템을 지속적인 품질 관리 및 세포 기반 요법의 자동화된 생산을 위한 폐쇄 루프 설정으로 통합하는 데 중점을 둘 것입니다.