제약 분석(DNA/RNA)의 흡광도 측정

1. 흡광도 개요

흡광도는 샘플이 흡수한 빛의 양을 측정한 것입니다. 빛이 빛의 일부를 차지하는 무언가에 닿으면 흡광도로 정의됩니다. 모든 빛이 시료를 통과하면 아무 것도 흡수되지 않으므로 흡광도는 0이고 흡수된 빛은 손실되지 않고 흡수 분자가 여기되면서 열이나 화학 에너지로 변환됩니다. 흡광도는 우리가 색상을 볼 때 매일 접하는 물리적 과정입니다. 햇빛과 같은 백색광에는 가시광선의 모든 색상이 포함됩니다. 녹색 잔디에 빛을 비추면 잔디는 모든 색상을 흡수하지만 녹색 빛은 다시 방출되고 이것이 잔디에 색상을 부여합니다. 특성은 특히 정량 분석을 위해 분광법을 사용하여 측정됩니다. 일반적인 흡광도 단위는 "흡광도 단위"라고 하며 약어는 AU이며 치수가 없습니다.

생물학과 화학에서 흡광도의 원리는 용액에서 흡수하는 분자를 정량화하는 데 사용됩니다. 많은 생체 분자는 특정 파장 자체에서 흡수합니다. 핵산과 단백질은 자외선을 흡수하고 엽록소는 파란색과 주황색/빨간색 빛을 흡수하고 헤모글로빈은 황록색 빛을 흡수합니다. 이러한 분석물은 최소한 백그라운드 흡광도가 낮은 용액에서 발견되는 경우 추가 처리 없이 정량화할 수 있습니다. 그러나 흡광도 정량화는 소수의 흡수 분자에 국한되지 않습니다. 화학 반응은 정량화를 위해 흡수 분자를 생성하는 데 도움이 됩니다. 이러한 반응은 특정 기질이나 효소에 따라 달라집니다. 따라서 발색(및 흡광도)이 더 강할수록 시료에서 더 많은 화합물/효소가 발견됩니다.

2. 핵산 농도의 흡광도 측정

핵산(DNA 및 RNA)의 흡수 분광법은 분자 생물학에서 매우 유용한 도구입니다. 핵산(DNA 및 RNA) 및 그 구성 요소는 240-270nm 영역에서 강한 흡수를 나타냅니다. 중성 pH에서 구아노신의 흡수 최대값은 253nm로, 시티딘의 흡수 최대값은 271nm로 이동합니다. 이것이 핵산 흡수 피크가 260nm 부근인 이유입니다. 그러나 기본 구성 및 환경에 따라 피크가 255에서 265nm로 이동할 수 있습니다.

그림 1: 260nm에서 DNA에 의한 흡수

DNA/RNA 농도를 결정하는 두 가지 접근 방식, 즉 형광 및 흡광도 측정이 있지만 흡광도는 샘플 준비 또는 염색 절차가 필요 없이 이 파장에서 빠르고 쉽게 흡광도를 측정할 수 있는 경우 점점 더 대중화되고 있습니다. 230nm, 280nm 또는 340nm와 같은 다른 파장에서 추가 측정을 수행하여 핵산 순도를 평가할 수 있습니다. UV 흡광도를 기반으로 한 핵산 정량화는 빠르고 쉽고 강력합니다. 물과 완충액이 다른 pH 값이 결과에 미치는 영향을 무시할 수 있습니다. 분광 광도계를 사용한 UV 측정으로 최대 몇 µg/µL의 고농축 샘플에서 DNA를 정량화할 수 있습니다.

UV 반응 및 흡광도 선형성을 관찰하기 위해 다양한 환경에서 다양한 농도 수준의 DNA 샘플에 대한 흡광도를 측정했습니다. 고흡광도 선형 분광를 사용하여 사용자는 측정 사이에 최소한의 시료 전처리로 광범위한 시료 농도 수준을 정확하게 측정할 수 있습니다. 이것은 매우 정밀한 측정 정확도가 요구되거나 작업할 샘플의 양이 제한된 응용 분야에 매우 중요할 수 있습니다.

3. 분광기를 이용한 응용

Ocean Optics의 SR6은 다목적 분광기로, 실험실용 설정 또는 대용량 산업 및 OEM 응용 분야에 통합된 맞춤형 시스템으로 적합합니다. 분광는 ~180-1100nm 내의 파장 범위를 포괄하는 모델에서 사용할 수 있으며 광원, 광섬유 및 샘플링 광학 장치에 연결하여 다양한 응용 분야에 대한 스펙트럼 설정을 최적화합니다.

SR6의 특징 중 하나는 UV 영역, 특히 180-280nm 범위에서의 반응입니다. SR6의 UV 응답은 주로 검출기의 기능이며 UV용으로 설계된 광학 벤치 구성 요소(회절격자 등)와 페어링하여 가장 잘 활용할 수 있습니다. UV 광원을 추가하고 UV 광을 전송하는 샘플링 광학 장치를 추가하면 애플리케이션에 최적의 구성이 제공됩니다.

그림 2: Oligo DNA 농도 0.5 - 100 µg/mL DNA(30개 농도)에 대한 SR6 흡광도

분광학 소프트웨어: 성능을 최적화하기 위해 분광용 맞춤형 소프트웨어 솔루션을 작성할 수 있는 Ocean Direct를 사용하면 SNR(신호 대 잡음비)을 개선할 수 있습니다. 결과적으로 주어진 시간 동안 SR6은 훨씬 더 많은 스펙트럼 평균을 수행하고 단위 시간당 훨씬 우수한 SNR(3500:1)을 산출합니다.

우리의 설정은 SR6 분광기, 중수소-텅스텐 할로겐 램프(UV 조명용 중수소 전구만 사용), 1cm 석영 큐벳이 있는 큐벳 홀더 및 태양광 저항성 광섬유로 구성되었습니다. 분광기와 광원은 사용 전 30분 동안 예열하고 필요에 따라 광섬유 가변 감쇠기를 사용하여 중수소 광원에서 분광기로 빛을 제어했습니다.