Phổ Ánh Sáng Trắng Để Theo Dõi Sự Phát Triển Của Nuôi Cấy Tế Bào T

GIỚI THIỆU

Các sản phẩm thuốc điều trị tiên tiến (ATMP) đại diện cho một loại dược phẩm mới cung cấp các phương pháp điều trị tiên tiến cho những bệnh nhân có các lựa chọn điều trị hạn chế. Các liệu pháp này thường liên quan đến các quy trình phức tạp như biến đổi gen và kỹ thuật mô, khiến việc sản xuất chúng tốn kém và chỉ giới hạn ở một số ít bệnh nhân. Một giải pháp tiềm năng để giảm chi phí và tăng khả năng tiếp cận là tự động hóa quy trình sản xuất, đặc biệt là theo dõi sự phát triển của tế bào T trong giai đoạn mở rộng. Các phương pháp đếm tế bào truyền thống, mặc dù hiệu quả, thường liên quan đến việc lấy mẫu, có thể gây ô nhiễm và làm tăng thời gian sản xuất. Ghi chú ứng dụng này khám phá việc sử dụng quang phổ ánh sáng trắng như một phương pháp không xâm lấn, thời gian thực để theo dõi sự phát triển của nuôi cấy tế bào T, cung cấp một giải pháp thay thế hiệu quả hơn cho sản xuất ATMP.

PHƯƠNG PHÁP

Hệ thống hấp thụ được sử dụng trong ứng dụng này. Theo truyền thống trong nuôi cấy tế bào, ước tính nồng độ tế bào dựa trên việc đo trực tiếp số lượng tế bào, bằng cách đếm từng tế bào một, vì kích thước tế bào giúp có thể quan sát trực tiếp chúng bằng kính hiển vi thông thường. Ngược lại, các phương pháp dựa trên hấp thụ như phép đo độ đục hoặc các kỹ thuật suy ra từ định luật Beer-Lambert (ví dụ như phép đo mật độ quang học) thường được ưa chuộng khi xem xét các thực thể sinh học nhỏ hơn như vi khuẩn.

Mục tiêu là đo phổ hấp thụ của dung dịch tế bào ở các nồng độ khác nhau và vẽ đồ thị nồng độ tế bào theo hành vi phổ. Điều này được gọi là "mô hình nồng độ quang học (OCM)".

Hình 1a cho thấy khả năng tái tạo và độ chính xác của các phép đo quang phổ cực kỳ tốt. Điều này được xác nhận khi tính toán số lượng tế bào trong bình bằng OCM. Kết quả được hiển thị trên hình 1b, trong đó các phép đo quang phổ được vẽ đồ thị với các ngôi sao màu đỏ cùng với các kết quả thu được bằng máy đếm tế bào tự động đã trình bày trước đó. Độ lệch chuẩn được đo trong tuần 15 bằng OCM cho thấy giá trị trung bình nhỏ hơn 2% với các giá trị cực trị là 0,4% và 3%. Như được nêu bật trên hình 1(b), số lượng tế bào trong bình tăng theo cấp số nhân theo thời gian như mong đợi.

Hình 1: Theo dõi số lượng tế bào bằng phương pháp quang phổ hấp thụ ánh sáng trắng. (a) Phổ thô được ghi lại trong tuần 15. Màu sắc chỉ những ngày, phổ được ghi lại trong cùng ngày được vẽ bằng cùng một màu. (b) Tổng số tế bào được tính toán bằng OCM (sao đỏ) so với số lượng thu được từ bình và cuvet có bộ đếm tự động.

Độ lệch chuẩn tương ứng với tất cả các thí nghiệm được báo cáo trên hình 2. Trên mỗi hộp, các giá trị ngoại lệ được vẽ riêng lẻ bằng cách sử dụng dấu thập đỏ. Có thể thấy rằng phép đo quang phổ dẫn đến giá trị trung bình thấp nhất (2%) trong khi các giá trị trung bình thu được bằng máy đếm tự động lớn hơn nhiều (8,5% đối với bình và 10% đối với cuvet). Ngoài ra, độ phân tán dữ liệu dường như lớn hơn khi lấy mẫu dung dịch từ cuvet so với trực tiếp từ bình.

Hình 2: Biểu đồ Box and Whiskers biểu diễn các SD được đo trong 8 thí nghiệm giám sát (được thể hiện bằng %). Các giá trị ngoại lệ được biểu diễn riêng lẻ bằng cách sử dụng dấu thập đỏ.

Hình 3 cho thấy dữ liệu thu được trong tuần 15 được điều chỉnh theo hàm mũ theo thời gian áp dụng cho số lượng tế bào được đo từ bình, cuvet và quang phổ tương ứng. Đối với ví dụ này, R2 của các đường hiệu chuẩn lần lượt là 0,97, 0,92 và 0,99 đối với bình, cuvet và quang phổ. Số lượng tế bào ban đầu được báo cáo là kết quả của dữ liệu điều chỉnh liên quan đến bình, cuvet và máy quang phổ. Bình ban đầu được gieo hạt với nồng độ CEM là 5×105 CEM.mL-1. Thể tích của nuôi cấy ban đầu là 15 mL, điều này biểu thị số lượng tế bào ban đầu theo lý thuyết bằng 7,5×106 tế bào. Có thể lưu ý rằng, bất kể phương pháp đếm là gì, số lượng tế bào ban đầu quan sát được đều cao hơn số lượng tế bào lý thuyết.

Hình 3: Phù hợp dữ liệu thực nghiệm thu được trong tuần 15 với các hàm mũ.

Thời gian phân chia đã được xác định từ việc khớp dữ liệu quang phổ. Chúng dao động từ 30 đến 50 giờ. Cuối cùng, một mối tương quan yếu cũng được nhận thấy giữa thời gian phân chia và số lượng tế bào ban đầu (hình 4) với hệ số tương quan R2=0,87. Trên hình 4, dữ liệu đã được khớp với hàm mũ để minh họa. Giá trị thấp của R2 khiến không thể kết luận rằng quá trình tiến hóa thực sự là hàm mũ.

Hình 4: Sự tiến triển của thời gian phân chia với số lượng tế bào ban đầu.

Hình 4 cho thấy thời gian phân chia tăng theo số lượng tế bào ban đầu. Có nghĩa là các tế bào phát triển chậm hơn khi chúng nhiều. Điều này phù hợp với động học tăng trưởng tế bào biểu hiện các pha khác nhau. Trong số đó, pha mũ tiếp tục cho đến khi những thay đổi trong môi trường như cạn kiệt chất dinh dưỡng và tăng sản phẩm trao đổi chất thải dẫn đến pha tĩnh. Sự tiến hóa mà chúng ta quan sát thấy trên hình 4 sau đó là hợp lý vì số lượng tế bào lớn hơn đặt nuôi cấy gần hơn với các điều kiện pha tĩnh.

XÂY DỰNG HỆ THỐNG

INTINS có thể cung cấp một hệ thống hoàn chỉnh cho ứng dụng này. Máy quang phổ UV-VIS Ocean SR4 là máy quang phổ hiệu suất cao với khả năng thu thập phổ tốc độ cao và hiệu suất tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu tuyệt vời cho nhiều ứng dụng khác nhau. Thiết bị có kích thước nhỏ này mở khóa dữ liệu UV-VIS từ 190-1100 nm và các tùy chọn khe hở vào có chiều rộng từ 5 µm đến 200 µm. Máy quang phổ SR4 nhỏ gọn, đa năng và tương thích với các nguồn sáng và phụ kiện Ocean Insight.

Dòng DH-2000 là nguồn halogen deuterium cân bằng duy nhất trên thế giới. Nó sử dụng công nghệ lọc tiên tiến để tạo ra quang phổ mượt mà trên toàn bộ phạm vi, đầu ra cân bằng từ 215 đến 2500 nm và loại bỏ các vấn đề liên quan đến bão hòa. Công nghệ tương tự này loại bỏ vạch alpha-deuterium trong vùng khả kiến. Sử dụng kết hợp đèn deuterium và halogen, DH-2000 linh hoạt và lý tưởng để đo mẫu có nhiều đặc điểm trong các vùng quang phổ khác nhau hoặc để phân tích nhiều mẫu khác nhau.

Giá đỡ Cuvette cho các cuvette có đường dẫn 1 cm được ghép nối thông qua các sợi quang kết thúc bằng SMA với các máy quang phổ và nguồn sáng để tạo ra các hệ thống quang phổ có diện tích nhỏ cho các thí nghiệm hấp thụ và huỳnh quang. Giá đỡ Cuvette có nắp đậy tích hợp hoàn toàn để loại bỏ ánh sáng xung quanh và có 2 khe lọc để cho phép lọc ánh sáng chiếu vào giá đỡ cuvette và/hoặc ánh sáng phát hiện ra rời khỏi giá đỡ cuvette. Thiết bị được thiết kế để giữ chặt các cuvette vuông 1 cm mà không cần người dùng điều chỉnh, mang lại khả năng lặp lại dữ liệu cao

KẾT LUẬN

Phổ ánh sáng trắng cung cấp một phương pháp mạnh mẽ và không xâm lấn để theo dõi sự phát triển của tế bào T theo thời gian thực, mang lại độ chính xác và khả năng tái tạo cao hơn so với các phương pháp đếm tế bào truyền thống. Phương pháp này không chỉ làm giảm nguy cơ nhiễm bẩn mà còn tăng cường hiệu quả của các quy trình sản xuất ATMP. Các phát triển trong tương lai sẽ tập trung vào việc tích hợp hệ thống giám sát quang phổ này vào một thiết lập vòng kín để kiểm soát chất lượng liên tục và sản xuất tự động các liệu pháp dựa trên tế bào.