Đo độ hấp thụ trong phân tích dược phẩm (DNA/RNA)

1. Tổng quan về độ hấp thụ

Độ hấp thụ là thước đo lượng ánh sáng được hấp thụ bởi một mẫu. Khi ánh sáng chiếu vào thứ gì đó lấy đi một phần ánh sáng, nó được định nghĩa là độ hấp thụ. Nếu tất cả ánh sáng đi qua một mẫu thì không có ánh sáng nào bị hấp thụ, do đó độ hấp thụ bằng 0 và ánh sáng được hấp thụ không bị mất đi; nó được chuyển thành nhiệt hoặc năng lượng hóa học khi phân tử hấp thụ bị kích thích. Hấp thụ là một quá trình vật lý mà chúng ta bắt gặp hàng ngày khi nhìn thấy màu sắc: Ánh sáng trắng như ánh sáng mặt trời chứa tất cả các màu của ánh sáng khả kiến. Khi nó chiếu lên cỏ xanh, cỏ hấp thụ tất cả các màu nhưng ánh sáng xanh lục được phát lại và đây là thứ mang lại màu sắc cho cỏ. Thuộc tính được đo bằng phương pháp quang phổ, đặc biệt đối với phân tích định lượng. Các đơn vị hấp thụ điển hình được gọi là "đơn vị hấp thụ", có chữ viết tắt là AU và không có thứ nguyên.

Trong sinh học và hóa học, nguyên tắc hấp thụ được sử dụng để định lượng các phân tử hấp thụ trong dung dịch. Nhiều phân tử sinh học đang tự hấp thụ ở các bước sóng cụ thể. Axit nucleic và protein hấp thụ tia UV, chất diệp lục hấp thụ ánh sáng xanh lam và cam/đỏ và huyết sắc tố hấp thụ ánh sáng vàng lục. Các chất phân tích này có thể được định lượng mà không cần xử lý thêm, ít nhất là nếu chúng được tìm thấy trong dung dịch có độ hấp thụ nền thấp. Tuy nhiên, định lượng độ hấp thụ không giới hạn ở một số ít phân tử hấp thụ. Các phản ứng hóa học hỗ trợ tạo ra các phân tử hấp thụ để định lượng. Những phản ứng này phụ thuộc vào một chất nền cụ thể hoặc vào một loại enzyme. Do đó, sự phát triển màu sắc (và độ hấp thụ) càng mạnh thì càng có nhiều hợp chất/enzim được tìm thấy trong mẫu.

2. Đo độ hấp thụ trong nồng độ axit nucleic

Quang phổ hấp thụ của axit nucleic (DNA và RNA) là một công cụ rất hữu ích trong sinh học phân tử. Axit nucleic (DNA và RNA) và các thành phần của chúng cho thấy sự hấp thụ mạnh trong vùng 240-270 nm. Ở pH trung tính, cực đại hấp thụ của guanosine chuyển sang 253 nm và đối với cytidine là 271 nm. Đây là lý do tại sao đỉnh hấp thụ axit nucleic ở khoảng 260 nm. Tuy nhiên, tùy thuộc vào thành phần cơ sở và môi trường, cực đại có thể thay đổi từ 255 đến 265nm.

Hình 1: Sự hấp thụ của DNA ở bước sóng 260 nm

Có hai cách tiếp cận để xác định nồng độ DNA/RNA, đó là phép đo Huỳnh quang và Độ hấp thụ nhưng Độ hấp thụ ngày càng phổ biến hơn khi có thể khai thác nhanh chóng và dễ dàng các phép đo độ hấp thụ của quy trình nhuộm hoặc chuẩn bị mẫu ở bước sóng này. Bằng cách thực hiện các phép đo bổ sung ở các bước sóng khác như 230 nm, 280 nm hoặc 340 nm, độ tinh khiết của axit nucleic có thể được đánh giá hàng đầu. Định lượng axit nucleic dựa trên độ hấp thụ tia cực tím nhanh chóng, dễ dàng và mạnh mẽ, nếu bạn bỏ qua giá trị pH tác động, sự khác biệt giữa nước so với dung dịch đệm, có thể ảnh hưởng đến kết quả. Các phép đo UV bằng máy đo quang phổ cho phép định lượng DNA trong các mẫu có nồng độ cao với vài µg/µL.

Để quan sát tuyến tính phản ứng UV và độ hấp thụ, chúng tôi đã đo độ hấp thụ của các mức nồng độ khác nhau của các mẫu DNA trong các môi trường khác nhau. Với máy quang phổ tuyến tính độ hấp thụ cao, người dùng có thể đo một loạt các mức nồng độ mẫu một cách chính xác và với việc chuẩn bị mẫu tối thiểu giữa các phép đo. Điều này có thể rất quan trọng đối với các ứng dụng đòi hỏi độ chính xác của phép đo hoặc khi bạn có một lượng mẫu hạn chế để phân tích.

3. Ứng dụng khi sử dụng máy quang phổ

Dòng sản phẩm SR6 từ Ocean Optics (Ocean Insight) là máy quang phổ đa năng, phù hợp để thiết lập cho phòng thí nghiệm hoặc là một hệ thống tùy chỉnh được tích hợp vào các ứng dụng OEM và công nghiệp khối lượng lớn. Máy quang phổ có sẵn trong các mẫu có dải bước sóng trong khoảng ~180-1100 nm và kết nối với nguồn sáng, sợi quang và quang học lấy mẫu để tối ưu hóa thiết lập quang phổ cho các ứng dụng khác nhau.

Một trong những tính năng nổi bật của SR6 là phản ứng của nó trong vùng UV, đặc biệt là phạm vi từ 180-280 nm. Phản ứng UV của SR6 chủ yếu là một chức năng của máy dò và tốt nhất có thể được tận dụng bằng cách ghép nối nó với các thành phần hệ quang học – độ chói và những thứ tương tự – được thiết kế cho UV. Thêm nguồn sáng UV và lấy mẫu quang học truyền ánh sáng UV cung cấp cấu hình tối ưu cho ứng dụng.

Hình 2: Độ hấp thụ SR6 đối với nồng độ DNA Oligo 0,5 - 100 µg/mL DNA (30 nồng độ)

Với phần mềm quang phổ: Ocean Direct, cho phép viết các giải pháp phần mềm tùy chỉnh cho máy quang phổ để tối ưu hóa hiệu suất, tỷ lệ SNR (tỷ lệ tín hiệu trên tạp âm) có thể được cải thiện. Kết quả là, trong một khoảng thời gian nhất định, SR6 sẽ thực hiện nhiều mức trung bình phổ hơn đáng kể và mang lại SNR vượt trội hơn nhiều trên mỗi đơn vị thời gian – cao tới 3500:1.

Thiết lập sản phẩm của chúng tôi bao gồm máy quang phổ SR6, đèn halogen deuterium-vonfram (chỉ sử dụng bóng đèn deuterium để chiếu sáng tia cực tím), giá đỡ cuvette với cuvette thạch anh 1 cm và sợi quang chống năng lượng mặt trời. Máy quang phổ và nguồn sáng được làm nóng trong 30 phút trước khi sử dụng và một bộ suy giảm biến đổi sợi quang được sử dụng, khi cần, để điều khiển ánh sáng từ nguồn deuterium đến máy quang phổ.